自5月27日水木未来正式启动“青年科学家支持计划”以来，在海内外生命科学领域引发热烈反响。就申请过程中普遍问及的样本特性及制备要求等问题，水木未来结合发表文献和丰富的实战项目经验进行解释说明，希望能够为结构研究的顺利开展提供参考。
*水木未来“青年科学家支持计划”申请中，免费kV冷冻电镜Initialassessment，期待您的参与和支持。
Q1
有必要在冷冻制样前，先通过负染检查样本质量吗？
YSSP：
即便有SDS-PAGE、分子排阻色谱（Sizeexclusionchromatography,SEC）、表面等离子体共振（Surfaceplasmonresonance,SPR）等结果证明蛋白纯度或复合物结合情况，也强烈建议在冷冻制样前利用负染对样本质量进行评估。负染是用重金属盐对铺展在载网上的样本进行染色，用滤纸吸去多余染料，经过自然干燥后，样本被镀上一薄层重金属盐，从而衬托出样本的轮廓结构，随后置于kV电镜下进行观察。虽然负染电镜相对冷冻电镜而言分辨率比较低，但仍然能够提供非常丰富的样本特征信息，诸如颗粒大小、均一性、寡聚状态、形态、颗粒密度/样本浓度，并利用2Dclassaveraging，还可以粗略分析蛋白结构、柔性、样本完整度、构象和组成的异质性等。需要注意的是负染评估也存在局限性，并非完全能够反映冷冻制样后颗粒的状态，更无法预测Cryo-EMSPA结构解析的最终分辨率。首先重金属染色剂会影响蛋白的稳定性，而小蛋白和核酸利用负染很难看到。另外负染也不能预判冷冻制样时颗粒入孔的比例、是否会存在优势取向等冷冻制样时经常遇到的棘手难题。少数情况下，染液晾干过程中蛋白样本还可能发生变性、解聚甚至塌缩，导致对样本质量的误判。但即便这样，负染仍是目前最优的质控手段，考虑到冷冻电镜数据收集的耗时和高成本，建议提前利用负染进行全面细致的可行性评估。负染常用的重金属染色剂包括乙酸双氧铀、甲酸双氧铀、磷钨酸钠等，不同染色剂pH值差别很大，如果蛋白对于pH值敏感，需要选择合适的负染试剂保证蛋白的理化性质。
01
02
03
图1.负染样本的染色深浅十分关键，Blot后留在载网上的染液体积及染色时间会影响染色结果（从左到右三张图分别为染色太浅、染色适中、染色太深）
Q2
数据分析时提到的优势取向是什么，产生的原因及改善的可能途径？
YSSP：
单颗粒分析从二维投影图重建得到三维密度图，需要尽量全面地获得蛋白在各个角度下的二维照片，至少保证获取的取向能够充分填充三维密度图傅里叶变换的系数。但是实际上蛋白/颗粒不会以完全随机的方式排列，很多情况是只有一个或少数几个主导取向，如果某一种角度或少数角度的照片占绝大多数，或者2D分类发现类型比较单一，则可能样本存在较为严重的优势取向问题。
产生优势取向的原因主要有两个方面：1）样本特性，比方形态学呈现棒状或者盘状，颗粒的长轴倾向于与载网平行的方式分布，2）气液界面（Air-waterinterface,AWI）接触，在AWI接触后，溶液中的蛋白会变性，形成不可溶的变性蛋白膜，这层膜会减少AWI的表面张力，并作为屏障隔绝溶液中剩下的蛋白颗粒与空气的接触。溶液中的蛋白颗粒被变性的蛋白吸附，吸附的方式则由颗粒局部与界面的亲和力决定，这样会使得颗粒取向趋向于一致。
改善优势取向是冷冻电镜结构解析领域的一大难题，可以从以下方面进行尝试（摘自Bio3DEM，张凯