自从年将它们描述为CD4+T细胞的一个独特子集以来，天然胸腺衍生的Treg已被研究作为一种工具性治疗方法，用于控制不需要的免疫反应和将宿主免疫系统重塑为耐受性[6]。将CAR技术（重定向抗原特异性）与Tregs的优势相结合，为实体器官或造血干细胞移植(HSCT)以及其他免疫相关疾病的耐受性诱导提供了一种新颖且有前景的治疗选择。然而，开发符合标准且稳健的良好生产规范(GMP)的生产流程仍然存在重大挑战。我们回顾了该领域的当前进展，并根据我们在开发Treg的经验和癌症CAR-T细胞的当前进展中吸取的经验教训，推荐改进当前CAR-Treg制造工艺的方法。
CAR-Treg技术不断发展的格局可以追溯到年，当时MacDonald及其同事报道了用靶向人类白细胞抗原(HLA)I类分子A2(A2-CAR)的CAR成功转导人类Treg[9]。Boardman及其同事证实了这些发现，他们表明表达类似供体HLAI-A2类特异性CAR的人类Treg能够减轻和预防人类皮肤异种移植模型中皮肤移植的排斥反应[10]。方框2提供了这些发现的更多细节。
除了同种异体反应性CAR-Tregs外，最近还开发了几种自身抗原特异性CAR-Tregs，并成功应用于T1糖尿病、自身免疫性肝炎、炎症性肠病、脑炎、关节炎和几种罕见疾病的临床前模型[11.,12.,13.]。
---CAR-Treg制造现状---CAR-Treg制造采用传统多克隆Treg生产（分离和激活）的初始步骤。所得产品（此处称为“Treg主产品”）随后进行基因修饰/CAR基因传递（图1、图2）。目前多克隆Treg细胞的制造工艺以单采或外周血制备的外周血单核细胞（PBMC）为原料（由3%的Treg组成），主要采用磁珠选择（磁激活细胞分选，MACS），尽管基于流式细胞术的荧光激活细胞分选(FACS)设备也已被应用（图1）。通常，CD8+细胞首先被耗尽，然后对CD25高的细胞进行阳性选择，导致CD4+CD25high+FoxP3+Tregs的富集(70%)。由于幼稚Treg更稳定且受T效应(Teff)细胞污染较少，其他方法依赖于通过额外消耗CD45RO+或富集CD45RA+细胞来富集幼稚Treg[14]。富集后，细胞被抗CD3/CD28珠和（高）外源性白细胞介素2(IL-2)激活。重复此过程以将细胞扩大几个对数（高达倍）[15]。为了通过污染Teff细胞的扩增来防止Treg不稳定，可以添加mTOR抑制剂雷帕霉素以选择性消耗Teff细胞[16]，即使不添加雷帕霉素也可以实现高纯度[17]。扩增2-3周后，Treg在质量控制(QC)测试中显示出高纯度(90%CD4+CD25high+FoxP3+)和高功能性（图1）。
图1.传统多克隆Treg细胞的当前制造工作流程。在第一个制造步骤中，以白细胞去除术或外周血为原料获得外周血单核细胞（PBMC）。从PBMC中分离Treg细胞群主要是通过基于特征标记表达谱的磁激活细胞分选(MACS)或荧光激活细胞分选(FACS)实现的。通过用抗CD3/CD28抗体包被的磁珠和（高）外源性白细胞介素2(IL-2)水平刺激来进行激活。可以添加mTOR抑制剂以防止污染效应T细胞的扩增（可选）。使用抗CD3/CD28抗体包被的磁珠加上（高）外源性IL-2，通过传代和连续培养基供应，重复扩增以在2-3周内将细胞扩增几个对数。在制造工作流程结束时进行无菌、身份和效力的质量控制(QC)检测。最终的多克隆Treg产品可以在冷冻保存后储存或新鲜给予患者（交付）。图2.CAR-Treg产品的当前制造工作流程和相关挑战。在第一个制造步骤中，以白细胞去除术或外周血为原料获得外周血单核细胞（PBMC）。从PBMC中分离Treg细胞群主要是通过基于特征标记表达谱的磁激活细胞分选(MACS)或荧光激活细胞分选(FACS)实现的。通过用抗CD3/CD28抗体包被的磁珠和（高）外源性白细胞介素2(IL-2)水平刺激来进行激活。可以添加mTOR抑制剂以防止污染效应T细胞的扩增（可选）。获得的Treg主产物使用GMP级慢病*载体通过CAR构建体进一步进行基因修饰。对于扩增，CAR-Treg细胞进行传代，并连续提供含有抗CD3/CD28珠和（高）外源性IL-2水平的培养基。在基因传递时提高CAR-Treg产品的纯度，可以在扩增期间进行富集过程（例如，使用CAR转导标记和/或FOXP3）（可选）。在制造工作流程结束时进行无菌、身份和效力的质量控制(QC)检测。最终的多克隆Treg产品可以在冷冻保存后储存或新鲜给予患者（交付）。在分离、激活和扩展分选的Treg后，使用表达CAR构建体的GMP级病*载体转导所得的“Treg主产品”。生成的CAR-Treg产品通过连续培养基供应和符合GMP的抗CD3/CD28磁珠和（高）外源性IL-2的再刺激得到进一步扩展。在制造工作流程结束时实施无菌、身份和功能的QC检测。最终的CAR-Treg产品可以进行进一步的细胞扩增，直到达到所需的细胞计数，然后冷冻保存或在制造后新鲜给予患者[18]（图2）。
制造CAR-Treg细胞的挑战和机遇
众所周知，细胞和基因疗法的制造过程复杂且成本高昂[19,20]，这随后会影响这些产品的转化成功[21,22]。当前的CAR-Tregs制造过程表明，在细胞纯化、产量、扩增、载体生产/转导、冷冻保存和产品发布测试方面存在多项挑战（图2）。
用于CAR交付的“Treg主产品”的纯度Tregs
代表PBMC中的一小部分(3%)。主要障碍之一是在符合GMP的分选条件下获得足够的产量和纯度。基于FACS实现高纯度(98%)的有效临床前分选策略尚不符合GMP要求。大多数当前的GMP协议基于半封闭的MACS设备。尽管可以通过扩增期间Treg的选择性生长来克服使用MACS的相对较低的分选后纯度（60–80%）（在“扩增和产量”中讨论），但扩增的Treg显示出由传统T细胞(Tconv)产生的高度可变的纯度就维持稳定的FOXP3表达而言，污染或潜在的Treg不稳定性，如下文所述（图2）。
因此，制造CAR-Treg的一个特殊挑战是防止污染的Tconv细胞被CAR转移重定向到特定目标，因为CAR构建体的基因传递发生在Treg扩增的中间阶段，而纯度仍然有限（图2）。通过CAR表达重定向Tconv细胞的抗原特异性会引起安全问题，因为它们不希望有增加的抗原靶向性。特别是，对于配备有疾病相关CAR（例如同种异体/自身抗原）的Treg，必须严格控制产生不可预测数量的具有疾病放大潜力的致病性Tconv细胞的风险。尽管最近使用第一代Treg的临床试验的安全数据令人鼓舞[23,24](NCT)，其中最终产品中少数具有多克隆T细胞受体(TCR)库的污染性Tconv细胞得到控制，但该问题需要进一步