TUhjnbcbe - 2021/6/7 16:35:00
缺血性脑血管病(ICVD)是威胁人类健康与生存的主要疾病之一，是中老年人的常见病，具有发病率、死亡率、致残率、复发率高的特点，是目前重点防治的一种疾病。大脑中动脉(MCA)为临床上发生脑缺血损伤最常见的部位之一。故大脑中动脉阻塞(MCAO)模型被广泛用于局灶性脑缺血的研究。用血管内线栓阻断法制备大鼠MCAO模型，已被脑血管病研究者广泛接受和采用。目前实验室较多采用MCA阻断0min、90min和min的短暂脑缺血-再灌注模型。实验方法：动物分组选用健康SD雄性大鼠,体质量至g,所有大鼠被随机分为正常组、假手术组、模型组3组,每组9只。大鼠腹腔麻醉后固定,分离右颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈(ECA)并挂线备用。结扎CCA与ECA,用动ICA远心端后,迅速在ECA与ICA分叉处作,切口处插入一端加热成光滑球形尼龙线。线ICA后,于入口处稍微结扎尼龙线与入口处ICAICA的动脉夹,继续插入尼龙线至稍有阻力后略回撤,至线插入深度为(18.5-0.5)mm左右,实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血,再次结扎入口处,尼龙线外留约1cm,缝合皮肤,2h后轻提所留线头至有阻力,实现大脑中动脉再灌注。此模型操作较为简单,缺血灶明确,可重复性强,同时模型动物存在明显的学习记忆障碍,是目前较理想的VD模型。模型评价：动物醒后约1h，即出现神经功能缺损情况，并借此判定手术成功性。TTC染色可检测手术成功的动物出现脑梗死灶。常规组织切片染色可见脑缺血区神经元、胶质细胞、血管及神经毡等损伤，以及星形胶质细胞增生、活化，炎细胞浸润等病理变化。观察指标：主要集中在其动物模型的行为学,皮质、海马区组织形态学、神经生化学、脑血流及血液流变学指标的研究领域上,把记忆认知功能缺损的改善作为一个主要标准。行为学指标，造模后的动物均表现出明显的学习记忆能力障碍。目前常采用跳台法、避暗法、穿梭箱法来测定动物一次性被动回避反射能力;Y形水迷宫实验、Morris水迷宫实验、八臂迷宫实验等测定VD动物空间分辨学习记忆能力。组织形态学指标，皮质及海马区的神经细胞的变化。海马区是脑缺血最敏感的区域，海马是脑内参与记忆储存功能的重要部分。海马CA1区在学习记忆中起重要作用。形态学观察发现模型组大鼠海马CA1区细胞排列稀疏、杂乱、细胞线不清晰,锥体细胞明显减少、尼氏体减少。(一)神经功能学评分神经功能包括意识状态、运动、感觉、视觉、共济和神经反射等多方面，在临床神经功能检查中以上方面都会得到体现。MCAO动物研究中，可根据动物的生理病理特点，从运动、感觉、意识、神经反射等方面检测动物的神经功能损伤和恢复程度。神经功能学评价不仅是判断模型成功与否的指标，也为观测病理生理发生发展的进程、模型规范化及药物干预的研究提供了一定的依据。1.ZeaLonga法ZeaLonga法为5级0～4分制：0分，无神经损伤；1分，提尾时对侧前肢内收屈曲(轻度神经损伤)；2分，爬行时向对侧旋转(中度神经损伤)；3分，站立或爬行时，向对侧倾倒(重度神经损伤)；4分，无自主活动伴意识障碍。通常MCAO再灌注动物模型制作成功后，死亡主要发生在2d内，而再灌注3d后，动物的死亡率则大大降低。此外，大部分3分者及所有4分者多在24h内死亡，2d内的死亡率几乎是％，主要原因是手术造成蛛网膜下腔出血和(或)脑水肿，因此所有不同再灌注时间点内的动物，取材时需摒弃蛛网膜下腔出血者。客观地讲，缺血1h的MCAO再灌注动物模型的“有效”成功率通常在60％左右，而缺血超过1h的MCAO再灌注动物模型“有效”成功率则更低。因此，在MCAO再灌注动物模型中，最有价值的应该是ZeaLonga评分1～2分者。此外，有部分ZeaLoga评分1分者的神经缺损症状可在1d内消失，取材后证实梗死灶多数在纹状体区，而皮质区无梗死。需要强调的是，术后部分大鼠出现缺血侧瞳孔缩小、眼裂变小等症状，即Horner征，由手术中损伤颈部交感神经，引起瞳孔开大肌与睑板平滑肌(Müler肌)麻痹所致，与脑缺血无关，因此不可将其视为手术成功的指标之一。在评分时，需注意1分为ZeaLonga评分所有2～4分的基础分。也就是无1分的基础分。2～4分的评分应视为无效。2.改良的GarciaJH评分该方法从大鼠自主运动、体态对称性、前肢伸展功能、攀爬运动、身体双侧触觉、双侧胡须碰触反应等6个方面评估大鼠神经功能损伤的程度。分值为3～18分，数值越大，神经功能损伤越轻，18分为正常。(二)组织取材于再灌注预定时间点用3.6％水合氯醛麻醉后，仰卧位固定大鼠四肢，迅速用剪刀自剑突沿胸骨左缘剪断肋骨，暴露胸腔，用左手轻轻固定搏动的心脏，在心尖处剪开部分心壁，用9号灌注针(头端膨大钝圆)刺破心壁自左心室插入主动脉后，结扎固定灌注针，剪开右心耳，用生理盐水(50～ml)快速灌注冲洗至右心耳流出液变清亮(根据不同的实验目的及要求，可在此时用10％中性甲醛或4％多聚甲醛做前固定处理)。用剪刀自枕骨大孔处迅速剪断脊髓，剪开头皮，暴露颅顶，剪掉颅顶部肌肉组织，用剪刀刻划各骨缝，用咬骨钳咬开枕骨大孔及枕骨暴露出小脑及左右顶骨的后缘，用止血钳将顶骨后缘沿正中骨缝向两侧掀开顶骨，暴露两侧大脑半球，然后用咬骨钳咬掉两侧部分颞骨及额骨，露出脑组织。用眼科剪将脑干底侧脑神经剪断，并剪开硬脑膜，轻轻掀起脑干，自后向前剪断颅底三叉神经和视神经，将整个脑与颅底结构分离，最后剥离嗅球并取出完整脑。整个取脑过程要求速度快。用时应尽量不超过10min，有条件者整个取脑过程可在冰浴中进行。取脑操作需轻柔，切忌刺伤、挤压脑组织，剪开硬脑膜要彻底，避免因硬脑膜牵拉而损伤脑组织。此外，需观察大鼠插线侧大脑动脉环MCA起始处附近有无出血情况等。(三)形态学观察2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法观察脑梗死灶：TTC染色后，未缺血部分呈玫瑰红色，而脑梗死灶呈苍白色(在MCA供血范围内)，证实模型制作成功。(1)TTC染色原理：TTC为一种水溶性盐，是呼吸链中吡啶一核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应，产生深红色、光酶脂溶性的Formazan而使正常组织呈玫瑰红色：缺血组织内线粒体损伤、脱氢酶活性下降，不能诱导染色反应而呈苍白色。(2)TTC染色步骤：将脑立即置于-20℃冰箱冷冻10min，用锋利双面剃须刀片按约2mm厚度，在距额、枕极2mm间做连续冠状切片，共取5～6个脑片。将脑片置于含0.5％TTC(用0.01mol/L的PBS配制，用时现配)的培养皿内，滤纸覆盖脑表面，37℃恒温培养箱避光染色20min。期间注意不时翻动脑片，以使染色均匀。(四)组织学观察取脑后，可选取距离额极6mm、3～4mm厚脑片行组织学检查。石蜡制片或冰冻制片后。行常规HE染色(或Nissl染色、免疫组化染色等)，在光镜下观察脑缺血后形态学改变，或制成超薄切片行电镜检查(图16-3)。光镜下。正常组动物神经元、胶质细胞及毛细血管形态正常，结构完整，核仁清晰，细胞质无红染，神经毡致密，无脱髓鞘现象，无炎细胞渗出。模型组：局灶性脑缺血-再灌注1d，脑皮质缺血区组织水肿明显，星形胶质细胞肿胀，神经元肿胀，中央尼氏体消失，可见红色神经元、神经元核固缩等神经元死亡现象及轴突崩解及脱髓鞘现象，可见中性粒细胞渗出；再灌注3d，神经元皱缩、死亡加剧，并可见少量小胶质细胞浸润，星形胶质细胞增生；再灌注7d，可见大量小胶质细胞吞噬坏死的神经组织，形成Gitter或Foamy(格子或称泡沫)细胞，缺血周围区神经元明显减少。星形胶质细胞及血管增生现象十分显著。电镜下，毛细血管正常，内皮细胞和神经元未见水肿，常染色质分布均匀，染色体无异常，核膜完整，线粒体丰富，嵴清晰完整，细胞器正常。模型组：局灶性脑缺血后，毛细血管周围高度水肿，基膜稍增厚，血管内皮细胞内线粒体数目减少，线粒体的大部分嵴融合消失，部分核膜融合消失。神经元核深染，染色质聚集、周边化，线粒体肿胀，嵴减少或消失，呈空泡状。内质网池扩张变形等结构改变，并且随缺血时间延长，突触结构异常，突触密度下降。如果您也对动物实验感兴趣，欢迎