冰冻切片(frozensection)是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法，其最突出的优点是能够较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片很重要。
为什么要使用低温切片技术？
1、快速的术中会诊和诊断。
2、为酶组织化学检测保留酶活性，为免疫组织化学和原位杂交检测保留抗原活性。
3、可保留下常规处理液中会被溶解的物质，例如液体。
4、在不暴露于化学物质和/或高温的情况下保持细胞形态。
5、可以在固定和非固定组织样品上进行切片。
为了得到高质量的冰冻切片，选择好的冰冻切片机和配套的一次性刀架是保证切片质量的关键。冰冻切片机主要有两类：
①恒温冰冻切片机（Cryastat）：为较理想的冰冻切片机，型号很多，但其基本结构是将切片机置于-30℃C低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至2-4μm，完全能满足免疫组织化学标记要求。切片时，低温室内温度以-15℃～-18℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。
②开放式冰冻切片机：包括半导体致冷切片机和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷冻切片机。切片时暴露空气中，温度不易控制，切片技术难度大，在高温季节 ，切片更加困难，且切片厚8～15μm，不易连续切片，但其优点是价廉，国内有生产。
防止冰晶形成的方法
组织在切片前需要冰冻，而冰冻过程容易使组织中的水分形成冰晶，从而影响抗原定位。一般认为，冰晶体积大而量少时，影响较小；冰晶体积小而量多时，对组织结构损害较大。含水量较多的组织中较易出现冰晶。
(1)速冻
使组织温度骤降，减少冰晶的形成。方法包括：
1)干冰—丙酮(乙醇)法：将～ml丙酮(无水乙醇)装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再冒泡时，温度可达-70℃，用一小烧杯内装异戊烷约50ml，将此烧杯缓慢置人干冰—丙酮(或无水乙醇)饱和液内，至异戊烷温度-70℃时即可使用。将组织(大小为lcm×0．8cm×0，5cm)投入异戊烷内速冻30～60秒后取出，置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内贮存。
2)液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制锡纸小盒(直径约2cm)，可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放人盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始汽化沸腾，此时小盒保持原位，切勿浸入液氮中，大约10～20秒后组织即迅速冰结成块。取出冷冻的组织块立即置入恒冷箱切片机冷冻切片或置人-80℃冰箱贮存备用。
(2)应用蔗糖溶液
将组织置于20％～30％蔗糖溶液l～3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量，可防止或减少冰晶的形成。
低温恒冷箱冷冻切片法
目前最常用的是低温恒冷箱冷冻切片法。
其主要原理和操作如下：
组织采集、固定与保存取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为15×15×2~3mm。新鲜组织和已固定的组织均可作冰冻切片。不同来源的组织可依据实验条件和实验目的而考虑采用不同的方法。
新鲜组织的制备采取新鲜组织后可通过迅速冷冻的方法进行切片前的准备。
常用冷冻剂包括：液氮、异戊烷、干冰、二氧化碳气体、气雾状喷雾制冷剂。冷冻剂的最佳选择是异戊烷和液氮。
使用液氮的问题在于组织周围易产生空泡，类似绝缘物一样，阻止快速均匀冷却组织，导致组织冷冻人为改变，给病理医师的诊断带来困难，这一点对肌肉活检标本来说特别明显。
液氮和异戊烷可以联合使用，速冻的方法是：在保温瓶中准备液氮约ML，在小烧杯中准备异戊烷约50ML，将盛有异戊烷的烧杯置于液氮中，预冷至无气雾。注意两种物质不能相混。准备一个导热性能好的金属底托预冷，放少量OCT，置于-20℃低温恒冷箱切片机内，待底托上的OCT开始冻结时，将取好的组织块放置于上。用长镊子夹住底托，组织朝上，迅速浸入异戊烷中，速冻20~30ｓ，即可取出。可以在室温中稍许放置1min左右，待组织标本升温至-20℃，便可开始切片。
注意：动物组织可直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。-20℃保存3月，-80℃长期保存。请勿保存于液氮。
固定组织的制备为防止水解酶和其他一些组织抗原的移位、弥散，需要预先固定组织，再进行冷冻处理。
采取新鲜组织后，4%多聚甲醛（4%PFA）4C固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜，PBS缓冲液洗三次，每次10-30min，20%蔗糖中浸泡1小时或过夜，4℃保存于20%蔗糖（含0.05%NaN3）中。
或者：固定新鲜组织于甲醛钙，4℃，18h，流水冲洗，或蒸馏水短时过一下。若组织较少，容易破碎，如肠镜活检组织，吸水纸吸干。组织放入蔗糖胶液中4℃，18ｈ。极小组织可以酌情缩短时间。固定组织块于组织托上方。蔗糖胶的配方：阿拉伯胶2ｇ，蔗糖60ｇ，蒸馏水ｍｌ，4℃保存。
为防止冰晶形成，包埋前可进行蔗糖处理。
PS：关于固定
临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。
标本经固定或不固定均可，但经过固定的组织切片冰晶少，细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰，而未固定的组织冰晶多，细胞挤压变形大，甚至会影响观察结果。因此，除特别需要外，一般较多采用组织固定后再行切片。
固定方法有浸入法和灌注法，浸入法主要用于活检和手术标本，以及其它不能进行灌注的组织固定。灌注法适用于动物实验研究。
用于组织固定的固定剂种类很多，包括醛类、非醛类、丙酮及醇类等，其中以中性缓冲液配制多种聚甲醛较为常用，组织固定时，一方面固定液要有足够的量，另一方面还要保持一定时间，一般在快速灌注固定取材后，多用相同的固定剂再固定4-6h，以使组织充分固定，这对保持切片的完整性尤为重要。
包埋冷冻切片的原理，是冷冻使组织变硬。冷冻组织中水分主要起像石蜡的浸蜡填充作用，冷冻的组织在切片前一般还需要用OCT等包埋剂包埋。
包埋和冷冻可以同时进行，这里讲一下包埋时候组织放入的技巧。
囊壁类组织需要竖立包埋，且切面含有整个组织面的全层，一般可以将几条立埋的囊壁排列在一起卷成“Ｕ字型”，可以帮助囊壁更好保持侧立。组织大小差异较大的，应该先包埋大块组织，并依靠大块组织摆放小块组织，这样可以最快的切到大小不同组织的最大面。细小的组织在包埋时，需要将底部垫高，防止因为切不到造成切片机损坏。包埋时可以选择先制作一个OCT冻托，在OCT接近凝固时，将组织快速“种植”包埋进半凝的OCT中。脑组织和脂肪组织应特殊对待。
切片实践经验告诉我们，大部分组织冷冻时为了减少与缩小冰晶的有害影响，应在-50℃甚至更低的温度下迅速冷冻，而切片时需要待组织温度回升到-25℃~-10℃时才适合。
切片前1小时将恒冷箱切片机的温度设定为-18℃左右，以备切片。切片时温度以-15—-18℃为宜，温度过低组织易破碎。不同的组织应设置不同的温度，如较大组织块或含有较多脂肪的组织应设置温度相对较低，而脑、脊髓等温度应当设置相对高些。
切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10--15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。
调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。
刀的角度要适当，否则不易连片。用载玻片贴附组织切片时，勿上下移动。
未经固定的新鲜组织在冰冻切片后应使用相应的固定剂固定10分钟。
冰冻切片后如不立即染色，必须用电风扇吹干，贮存于-80℃低温冰箱内或进行短暂预固定后低温冰箱保存。染色前从冰箱内取出切片，置室温干燥10分钟，再经冷丙酮固定5～10分钟(未固定者)，PBS漂洗3次后即可进入染色程序(HE染色可用甲醛、冰醋酸和95％乙醇快速固定1—2分钟)。
注意事项
1、温度设置不当，组织块过冷、过硬，切片就容易破碎，组织块冷冻不够，硬度和韧度达不到，切片也同样易粘、易碎。当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。
2、切片刀钝或较脏，切片出现刮痕，使切片不完整。
3、组织固定不完全可能造成切片破碎、不完整。
4、切片刀的最适宜温度为-50℃，虽然对大多数组织和一般情况而言，切片刀的温度在-20℃就能得到比较满意的效果，但是有时为了得到更薄的连续切片，需要将其温度降至-30~-50摄氏度。使用效果好的半导体制冷或在低温恒冷箱冷冻切片迹象内使用干冰制冷，可达到这一要求。
贴片常见问题及处理
1、载玻片粘不上切片。此情况多见于准备片染的载玻片温度过低，只要使载玻片与切片间有一定温度差，切片即可贴到载玻片上，一般将载玻片置于常温即可。建议载玻片放置室温，因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。
2、贴片时切片易碎。排除固定不充分等因素外，漂片处理贴片时应注意动作轻、稳、准。根据切片大小，选用笔尖软硬适中、大小合适的毛笔，将笔尖伸入片下水中，往上轻轻将切片挑起，并展开。
3、切片脱落。影响切片粘贴牢固程度的常见原因有：载玻片不干净；载玻片粘附剂处理不好；贴片后，粘贴尚未牢固即进行反应。
可采取以下措施：保持载玻片干净，新买的载玻片经正规洗涤后，在95%的酒精内浸泡2h，用绸布擦干或用红外线烤箱烤干再使用。载玻片粘附剂种类较多，如铬矾明胶，配制后即可涂片，置37谁说的温箱烤干。贴好的玻片，可放入恒温烤箱内适当烘干，增加组织与玻片的粘贴。
冰冻切片的保存冰冻切片后如不能及时染色，可在干燥后装入密封的标本盒内，外包塑料袋，贮存于低温冰箱，或进行短暂预固定后于低温冰箱保存。
甲醇固定时间快，细胞收缩小，对细胞核和抗原保存较好。缺点是挥发性强，*性较大。９５％乙醇是兼有脱水作用的固定液，渗透力弱，固定速度慢，对糖原蛋白固定效果较好，能溶解脂类，易造成组织细胞收缩。丙酮能使蛋白沉淀，渗透力强，细胞收缩严重，对细胞核固定相对较强，对酶的固定较好，作用相当于乙醇，对糖原没有固定作用。AF液是乙醇和甲醛液混合的固定液，兼有乙醇和甲醛液的作用，固定的同时有脱水的作用。ＡＡＦ液与ＡＦ液固定液作用相似，固定同时有脱水作用。因其中多了冰醋酸成分，故能迅速固定染色质，且固定效果均匀，还能抵消一部分乙醇对组织的收缩作用。
免疫荧光标记将冰冻组织切片从-80°C冰箱中取出，室温放置10min,待切片回温并干燥，PBS10min洗去OCT，可无需Triton处理，即可进行免疫抗体标记，操作步骤与培养细胞反应方法相同。
免疫酶反应(酶联免疫反应，在抗体作用之前或显色时组织样品需进行内源性酶抑制作用，以降低反应背景)
碱性磷酸酶（AP）:
辣根过氧化物酶（HRP）
参考资源
马恒辉,周晓*.如何提高冷冻切片的技术水平.临床与实验病理学杂志,Jan;27(1).
中华医学会.病理学分册.临床技术操作规范.北京:人民*医出版社,4,10-2.
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