Cryo-SEM的优点
Cryo-SEM能以一种快速和可靠的方式研究含水的样品，这避免了传统化学固定方法保存湿样品的缺点，可以真实的观察显微结构。样品被低温固定，然后转移到SEM内的一个低温支架上。该技术对所有湿样品都有用，尤其是食品和药品以及生物样品。低温冷冻过程有很多优点：
.试样可以在完全含水的状态下观察。
2.避免了传统处理（通过化学固定和脱水）所带来的人工假象。即使用特定的干燥技术，也不可能避免含水样品的一些变化，尤其是样品的收缩。
3.样品制备通常是快速和相对简单的。传统的SEM处理方法涉及许多步骤，会很耗时。对于Cryo-SEM来说，可能在不到一小时内就能观察样品。
4.产生较少的机械损伤。许多脆弱的样品在标准处理和干燥过程中会出现塌陷或破损。
5.几乎没有可溶性或扩散性成分的损失，也不需要重新定位。这使得冷冻样品成为微分析研究的理想选择。
6.避免使用和接触传统处理中涉及的有*化学品。
7.可以观察液体样品，如乳剂或凝胶。
8.低温固定可以很快终止动态过程并及时观察，也可以通过定时冷冻样品来跟踪与时间演变的实验过程。
9.允许观察对电子束或高真空敏感的样品。在冷冻状态下，样品即使在高真空下也是稳定的。
0.通过割断冷冻样品，可以观察横截面来研究样品的内部结构。
左图：西葫芦上霉菌的Cryo-SEM图像(染色)。右图：蚜虫的Cyro-SEM图像。图片由PetaClode和JeremyShaw提供，西澳大利亚大学
左图：蛋*酱的Cyro-SEM图像。右图：使用背散射探测器成像的牙膏Cyro-SEM图像。图片由西澳大利亚大学的PetaClode和LynKirilak提供。
2Cryo-SEM的设计
样品冷冻后，需要持续保持低温以进行后面的制备步骤和成像。因此，需要额外的配件来防止样品解冻：冷冻转移系统和冷冻制备室，再加上对Cryo-SEM的配件：气锁、冷冻台和防污染器。
冷冻转移系统是一种在Cryo-SEM各工作流程之间转移样品的设备，可使样品从外部的样品制备室转移到样品仓过程中始终保持低温和真空状态。
冷冻制备室是在真空和冷冻条件下对样品进行断裂、蚀刻和镀膜的地方。它可以直接连接到扫描电镜上，也可以是一个独立的台式装置。
Cryo-SEM平台必须温度可控温度，通常允许温度在-40°C和-80°C之间。安装在电镜上的气锁系统可以方便快速地转移样品，而不需要对样品仓进行排气。
防污染器或冷冻防护罩直接位于冷冻台的上方，在冷冻准备室和Cryo-SEM中都是必不可少的，这些防污染器的尺寸相对较大，而且温度必须比样品本身更冷，使其成为最可能的冷凝污染目标。
Cryo-SEM设备示意图
3样品制备——冷冻和冷冻转移
Cryo-SEM的样品制备相对快速和简单，有4个主要步骤：.冷冻，2冷冻样品的转移，3样品表面的升华以暴露出感兴趣的结构，4镀导电膜或不镀。另外，如果想暴露样品的内部结构，那么在升华之前需要进行断裂或冷冻切割。
3.冷冻
在液态丙烷或液态乙烷这样的冷冻剂中骤然冷冻，或高压冷冻通常是实现高质量冷冻的首选方法。然而，许多样品，如叶子、花瓣或昆虫，拥有像角质层这样的保水表面，可以直接投入液氮中，尽管冷冻速度相对较慢。此类样品通常在相对较低的放大率下观察的样品表面，因此，这种较慢的冷冻速度是可以接受的。为了获得更好的冷冻质量，在Cryo-SEM中经常使用氮气泥。这种泥浆形式是通过将液氮置于真空下而产生的，由于其潜热较高，温度较低，为-20°C，相对于液氮而言，可以实现更快的冷冻速度。
3.2冷冻转移
冷冻转移装置用于转移样品，它与每个仪器机械对接。在这个转移系统中，样品在转移装置的末端骤然冷冻，然后直接移动到冷冻制备室，最终移动到Cryo-SEM中。更先进的系统是在整个过程中，主动保持样品的冷冻和真空状态，以确保转移过程中的稳定性和清洁度。
低温转移装置可以方便的转移样品。在转移过程中，样品始终保持低温和真空状态
4样品制备—冷冻断裂和刨削
除非要研究的表面是自然暴露的，否则有必要对样品进行断裂或切割，以显示内部结构，以去除不代表真实样品的材料。一般来说，冷冻断裂的样品比用锋利的刀片切割新鲜样品得到的表面要干净得多。
不幸的是，在冷冻断裂中，断裂面的路径无法控制，因为它优先沿着界面，如膜脂双层的疏水内区。在一个复杂的系统中，如细胞，断裂平面经常从一个膜双分子层切换到另一个膜双分子层，在细胞器和细胞膜之间交叉断裂细胞质，产生一个半三维的细胞结构视图。
断裂装置通常是一个冷却的钨刀片，可以手动使用，也可以以微米级尺度机械驱动，设备通常安装在冷冻制备室中。尽管断裂的高度可以设定在一微米以内，但冷冻样品很脆，所以很难精确地确定断裂的位置。可以再初步观察后，有可能对样品重新断裂，以依次观察样品的不同平面。
如果需要控制断裂的平面，或者断裂面需要一个平整的面，通常可以使用另一种技术--冷冻刨削。冷冻样品转移到冷冻超微切片机上，然后用玻璃刀或冷冻钻石刀以高度控制的方式（从微米到纳米级）来刨削表面。这样，就可以精确的确定感兴趣的截面区域。平整的表面对于准确的形态观察和能谱分析是必不可少的。
A.冷冻断裂和B.冷冻刨削的比较。在冷冻断裂中，断裂倾向于沿着阻力最小的平面，如沿着膜的疏水界面，然后穿过细胞质，直到到达下一个膜。冷冻断裂则形成一个没有凸起的光滑表面。
同一样品不同断裂方式的比较：A.冷冻断裂和B.冷冻刨削。在冷冻断裂的情况下，样品显示出一些三维形貌，而冷冻刨削的样品表面光滑。
5样品准备-升华
升华有两个重要的功能。
.在冷冻和转移过程中，由于水在寒冷的表面上的凝结，样品表面会被霜污染。升华将其从表面去除，从而暴露出原始样品结构。
2.由于暴露了样品内部的结构，使三维的超微结构得到了更好的观察。在穿过样品的裂缝中，尤其是膜会被抬起来，因此显示出细胞组织。
升华过程需要精确控制样品的加热，温度区间在-90°C至-0°C范围内，加热速率是真空值和温度的函数。升华可以在样品仓内进行，可以同时观察样品，并判断该过程何时完成。考虑到材料对电子束的敏感性，建议在低电压下观察。
此外，升华所需的温度和加热时间通常是根据经验确定的，并在涂层或制备室进行。当达升华完成时（根据经验），需要将样品温度降低以停止这一过程。如果升华过度了，会导致样品中的结构崩塌。
纯水的理论相图，显示了纯水在不同压力和温度下的升华率。较差的真空和较高的温度都会导致升华率的增加。计算结果基于Umrath()Mikroskopie40,9-37。图表由昆士兰大学的RogerWepf提供。
一旦升华过程完成，样品通常需要溅射一层金属涂层或在-30°C的温度下蒸镀一层碳[]。目的是是和常规SEM一样，样品须导电以便成像。
备注[]：可以尝试不镀导电膜，现代场发射电镜都可以不镀膜在低加速电压下成像
在大多数现代的冷冻制备系统中，这一制备过程是完全自动化的，升华和镀膜的工作曲线都可以保存下来供将来使用。
A.冷冻刨削后的三叶草的根，因此没有显示出明显的结构。B.升华后，显示细胞结构。C.在准备过程中，凝结并覆盖在冷冻样品上的霜。D.升华去除霜污染后的样品。图片由澳大利亚国立大学的HuaChen和西澳大利亚大学的PatrickHayes提供。
6样品制备-镀膜
生物样品天然不导电，在常规操作电压下，很难在SEM中直接观察。Cryo-SEM也不例外，样品会受到充电效应、电子束损伤和信噪比的影响。为了缓解这些问题，样品通常会镀上一层细小的（通常是几纳米）金属或碳涂层，金属或碳来自冷冻制备室内置的溅射镀膜机。镀膜使样品具有导电性，免受电子束损伤，并提高SE和BSE的产率，获得良好的成像质量。金属涂层一般选择诸如铂金、金或钯等。此外，配置场发射扫描，可尝试不镀导电膜，在低加速电压下直接成像。
防晒霜的Cryo-SEM成像，（A）未镀膜，显示充电，（B）镀膜，显示良好的成像质量。
7Cryo-SEM操作
在Cryo-SEM中，冷冻样品需要在冷冻台上观察，通常在-40°C以下，以避免样品的进一步升华。此外，必须使用一个罩在样品上方的防污染器，并保持低于样品的温度，以防止污染。SE和BSE探测器都可以用于Cryo-SEM。低加速电压通常用于表面成像，但对于稳定的样品，也可以使用更高一点的电压（尤其是针对半导体探测器）。
在选择操作参数时，需要考虑以下几点：限制样品充电（如调整电子束电流、扫描速率、改善导电性/涂层）。2避免电子束损伤（例如，调整放大倍数、电子束电流和镀膜类型）。3调整扫描速率以优化信噪比。4考虑景深，特别是对大型样品而言。5信号的优化（例如，表面细节优选低电压和SE信号，成分信息优选高电压和BSE信号）。
8Cryo-SEM的元素分析
在进行EDS元素分析时，对含水的样品进行冷冻几乎是金标准（快速冷冻下，没有升华或升华非常少），因为不会有元素移动位置或损失。在生物学中，许多组成元素，特别是轻元素，很容易扩散，通过其他的样品制备方法，不可避免地会导致一些元素从样品中移动或损失。
白千层叶片的氯、硫和氧元素图（冷冻刨削）。O元素分布图显示了该植物的结构。图片由西澳大利亚大学的CaioGuilherme-Pereira提供。
EDS既能定性分析，也可以定量分析，以确定元素的含量。冷冻样品中的元素含量是以mmolkg-为单位的，这比以干重为单位的浓度更有生物意义。
样品的冷冻断裂对定性结果来说是足够的，但为了可靠的定量分析，需要一个平坦的表面，因为形貌起伏会影响X射线的检测，特别是轻元素的检测。冷冻刨削可以产生一个非常平坦的表面，适合定量分析，但不能很好的显示样品的任何结构信息。
由于碳和氧在不同的生物结构中的浓度不同，这些元素的分布图对于揭示基本结构特别有用，但在升华过程中需要非常注意温度和时间的控制。
叶片的碳和氧元素图（冷冻刨削），显示了SE图像中不容易观察到的细胞结构。图片由PetaClode提供，西澳大利亚大学
为了不影响EDS的定量结果或避免一些重叠峰的干扰，冷冻样品最好镀上一层与感兴趣的元素不重叠的材料，常见的膜层包括碳、铝或铬。对于大部分生物材料，5kV的加速电压足以激发大多数感兴趣的X射线（包括锰、铁、铜），并提供大约2μm的空间分辨率。
9Cryo-SEM的假象
在Cryo-SEM的样品准备，及后续工作流程中的任何阶段都可能会引入人工假象。为了尽可能的避免假象，样品最初的冷冻和保存是最重要的步骤。由于SEM的样品通常比较大，要实现整个样品的玻璃态（无冰晶）保存可能很困难。然而，如果只观察样品的外表面，这比观察内部结构的问题要小。当冷冻速度很慢时，形成的冰晶概率很高并且会比较大，会损害或破坏样品的微观结构。
Cryo-SEM图像中的假象另一个重要来源是污染。由于样品温度非常低，环境中的污染物很容易沉淀在样品表面。污染物可能来自样品仓，比如真空系统中使用的油的碳氢化合物，或者来自样品本身，如从样品表面升华的水分子，或来自空气（如水/霜）。通过仔细处理试样和使用抗污染装置可以减少污染。
在Cryo-SEM工作中遇到的假象。A.蚜虫样品上的充电效应。B.霜冻污染。C.水凝胶样品的冷冻损伤。D.负载银纳米颗粒水凝胶上的局部电子束损伤（BSE成像）。图片由VictorMatsubara和PetaClode提供。
参考资料