当病*入侵哺乳动物细胞时，最初识别病原DNA收到这一“情报”的蛋白发出信号，向下一个蛋白传递，环环相扣，激活天然免疫反应。哺乳动物细胞正是利用这样的多条天然免疫通路介导免疫应答。
那么，细菌等原核细胞又是如何对外源DNA进行“天然免疫识别和应答”呢？
近日，《自然—微生物学》在线发表了中国科学院生物物理研究所高璞、章新*团队的最新研究成果。这项研究着眼一种细菌识别外源入侵DNA的免疫防御系统，即I型限制修饰（TypeIR-M）系统。利用冷冻电镜技术，研究人员系统性解析了TypeIR-M系统与靶标DNA及两种噬菌体抑制蛋白（Ocr和ArdA）的多种生理构象的三维结构，并配合突变及生化分析，揭示了该系统的组装、催化和调控机制。
6个步骤展开细节
TypeIR-M系统广泛存在于原核生物中，可以对宿主自身DNA进行甲基化修饰，并对未经修饰的噬菌体DNA进行识别和切割，从而为宿主细胞提供强大的天然免疫保护。
高璞向《中国科学报》介绍，自年这一系统被鉴定以来，许多研究人员利用微生物学、生物化学及分子生物学等手段对其开展了广泛研究。
“例如，我们已经知道该系统包括的亚基（蛋白）种类、不同TypeIR-M系统特异识别的靶标DNA序列、TypeIR-M系统存在的组装方式以及噬菌体编码蛋白可抑制该系统的活性等。”
但是，在分子甚至原子水平上仍然有很多问题未得到解答，比如不同亚基之间如何相互作用并组装成有特定功能的复合物，TypeIR-M系统是否以及如何通过构象变化来精确调控不同的酶活性，TypeIR-M动态构象变化的结构基础是什么，噬菌体蛋白抑制TypeIR-M系统酶活性的分子机制是什么。
为回答这些问题，必须了解TypeIR-M系统在不同构象状态及组装方式下的结构信息。
多年来，高璞一直致力于揭示TypeIR-M系统的组装、催化和调控机制。年，其在攻读博士期间就解析了该系统DNA识别亚基的晶体结构。年，他与中国科学院生物物理研究所梁栋材院士课题组合作，解析了该系统甲基化酶复合物在不结合靶标DNA状态下的晶体结构。而此次的最新成果，则是他们团队与章新*课题组合作，解析了该系统多个生理状态下的冷冻电镜结构。
基于最新研究，研究人员将TypeIR-M全酶的工作模型表述为6个步骤：第一，未结合靶DNA时，全酶复合物处于一种动态开放的静息状态；第二，结合靶DNA后，全酶复合物转变为紧凑的转位状态，并将DNA定位于两个R亚基的Motor-1和Motor-2结构域之间；第三，通过水解ATP，两个R亚基开始催化DNA转位，并将DNA从两端拉向TypeIR-M复合物，进而形成特殊的DNA环状结构；第四，当DNA转位受阻时，TypeIR-M全酶转变为中间态，此时仅有一个R亚基具有DNA转位酶活性；第五，通过两个R亚基的协同作用，全酶复合物进入切割状态，两个R亚基的核酸酶结构域和两个M亚基的催化结构域均靠近DNA，发挥DNA切割和甲基化修饰功能；第六，切割和修饰结束后，全酶复合物与DNA相互分离并返回到初始的静息状态。
冷冻电镜助力“凝固”瞬间
为了更清楚地理解上述状态转变过程，研究人员在冷冻电镜的帮助下“凝固”了其中的多个瞬间。
“首先实验的第一步是要获得高质量的复合物样品，我们采取细胞内共表达以及体外重组相结合的方式，以经典的TypeIR-M系统EcoRI为研究对象，制备了核心复合物M2S1以及全酶复合物R2M2S1。然后，进一步获得了它们与靶标DNA及两种噬菌体抑制蛋白（Ocr和ArdA）的复合物样品。”高璞表示。
接下来，研究人员利用冷冻电镜单颗粒重构方法，摸索了上述多种复合物样品的制样及数据收集条件，并解析了不同分辨率的共10种状态的三维结构。
事实上，围绕TypeIR-M系统为什么能够转位、切割以及修饰DNA，前人的研究已经了解其在不同阶段会显示出不同的酶活性，但是却不知道这个大的分子机器发生状态变化的根本原因。
冷冻电镜技术为了解这一过程的空间构象变化提供了“利器”。例如，在第一个阶段，TypeIR-M系统只有转位酶的活性、不具有切割和甲基化活性，原因是其酶切活性中心在结构上被“挤”在中间，形成“自我抑制”的状态；而甲基化酶催化域也同时距离DNA较远，导致其不具备甲基化活性。
“从冷冻电镜结果上看，这是非常直观且显而易见的。”高璞介绍。
TypeIR-M全酶复合物的工作模型图工具性意义
在原核细胞中，“R-M系统”及“CRISPR-Cas系统”是细菌去除入侵的噬菌体DNA的两种防御系统，而这两种系统都已经被开发成强大的生物学工具，广泛应用于生物医学研究中。
高璞强调，由于R-M系统中的酶能识别特异的DNA序列并进行修饰和切割，因此，当下分子克隆等实验，都要广泛用到R-M系统。不过，TypeIR-M系统虽然最早被发现，但由于大家对它的工作机制理解不够透彻，其工具开发一直相对滞后。
因此，对TypeIR-M系统工作细节的了解，有助于将来对其进行生物学工具开发。
同时，在细菌对外源DNA的免疫识别方面，此项研究揭示了TypeIR-M系统的组装、催化和调控的分子机制，这有助于深入理解该防御系统与噬菌体之间的相互博弈。
在结构生物学技术方面，TypeIR-M系统多种生理构象的三维结构解析，是困扰该领域数十年的难题，该工作首次系统性揭示了多种构象的结构基础。
此外，该研究还有望为抗病原菌感染的噬菌体疗法提供依据和思路。
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