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无论民间还是科学界，谈及存储细胞，都形容是在保存“生命种子”，是对未来的未雨绸缪。然而这份“希望”是否也有保质期呢？待到5年，10年，甚至百年之后，这些存储起来的细胞还有用吗？
答案是肯定的，在-℃液氮加持下，细胞的保质期理论上有百年之久。
那么液氮究竟是如何做到的？细胞内部到底经历了哪些神奇变化？这篇文章将带你深度探讨。
古往今来，尽管人们都难逃死亡一吻，但对“长生”的追求却依旧狂热。
7年，癌症晚期的美国心理学家詹姆斯·贝德福首次尝试“穿越时空”，他将自己的身体冻存在深低温仓中，期望50年后成熟的永生科技能将他唤醒、续命。
△世界上第一例人体冷冻手术
如今计划已经逾期5年了，詹姆斯能否成功苏醒，似乎还需要更长的时间去解答。但冻存生命并不是幻想，至少在细胞层面，科学家们已然实现。
据悉，最长的精子冻存时间已经迈过50个年头[1]，这不是说细胞保存的上限是50年，事实上，照这些精子在年还活性依旧的样子，再保存个几十年似乎也并非难事。
△悉尼大学动物繁殖专家SimondeGraaf团队复苏冻存50年精子
而之所以能做到这一点，首先我们要谈到塑造深低温环境的关键物质--“液氮”。
01
-℃液氮
为生命活动按下暂停键
19世纪的科学界曾陷入一场疯狂的低温竞赛。
无数科学家执着于挑战一项不可能完成的任务--“绝对零度”（-℃）。
法国科学家路易斯·保罗·卡耶泰（LouisPaulCailletet）亦是其中一员，而经过多年钻研，他终于将比赛的进度条拉到了-℃，液滴状的液氮从此诞生。
△路易斯通过焦耳-汤姆森效应分别制得了液氮（-℃）与液氧（-℃）
与此同时，科学界对冻存的概念却还不明晰，直到20世纪前后，科学家才意识到生物成分在低温中存储的益处。而随着冻存技术不断升级，超低温-℃的液氮也开始参与存储。两相结合，尤为合拍。
首先，自温度降至-℃开始，细胞内部便不会发生热依赖性代谢过程了，当温度来到-℃，此时细胞内能极小，分子运动趋近于停止[2]，就像细胞内的时间被按下了“暂停键”，生命活动也被冻结。
所以，排除其他外部因素，在-℃的环境里，细胞是可以实现“永生”的。
△在-℃液氮环境中，连微生物也无法生存
其次，氮气具备优秀冷却剂的特质，它无色无味，性质非常不活泼，基本不会对被冻存物体的化学性质产生影响。
最后，液氮的制成更方便安全。尽管液氦（-℃）温度更低，但氮气作为大气中含量（78%）最高的气体，其制成液氮后可以更广泛地用于实验与冻存中，这一点是稀有气体制成的液氦无法比拟的。更何况，-℃的低温对于大多数实验来说，本就绰绰有余。
所以综合来看，液氮是一种优异的冷却剂，在它的“庇护”下，细胞是有可能实现永久生存的。
说到这，可能有人还会有新的疑惑：市面上存在着一种“液氮疗法”，在这种治疗手段中，液氮是作为消灭体表肿瘤的“杀手”而存在的，这是否与前面的保护作用自相矛盾了？
这个问题其实忽略了液氮冻存的背后英雄-冷冻保护剂。要知道，在细胞冻存中，并不是只有液氮在单兵作战。
02
冷冻保护剂+梯度降温
为细胞存储保驾护航
低温之于细胞，可能是一把双刃剑。虽然-℃能将其长期冻存，但想让细胞安然横跨度的温差可不是一件简单的事。
要是冻存速度过快，比如直接将细胞丢进-℃的液氮里，温度的巨变足以在分秒内将细胞杀死，原因在于：陷入低温环境时，细胞内外的水分会迅速结冰，所形成的冰晶又会刺破细胞膜，造成不可逆转的“冰晶损伤”--这也是“液氮疗法”的主要原理。
△迅速降温会导致细胞内产生冰晶，刺破细胞膜及细胞器
如果冻存速度过慢，细胞外部的水又会结冰，使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，导致细胞脱水或者电解质失衡，继而造成“溶液损伤”。
所以为求一个“刚刚好”，研究人员在液氮存储时，都会使用“冷冻保护剂”及“梯度降温法”。
先说冷冻保护剂，顾名思义，它能保护细胞抵抗低温损害。
含硫有机化合物“二甲基亚砜”（DMSO）便是其中一种。作为备受青睐的保护剂，它一方面能稳定细胞蛋白并置换细胞内液，以平衡细胞内外的电解质浓度，一方面还能与水分子形成高能氢键，降低冰点，减少细胞内部冰晶的形成[2]。在冻存过程中可能出现的各种损伤，似乎都能被它一一化解。
当然，并不是说添入冷冻保护剂，便可以一劳永逸，冻存过程中的温度控制依然至关重要。
实验室里一般都会采取梯度降温法，如按照4℃，-20℃-80℃，-℃（液氮）的顺序逐级给细胞降温，让细胞有足够的时间（部分实验会让细胞在-80℃维持1-2天再继续降温），去适应温度，减少冻存过程对细胞造成的损伤。
△干细胞冷冻保存流程示意图
同时为了规避人为操作带来的误差，实验中还会配备精准降温的程序降温仪，让细胞环境能够以稳定的1℃/min（或其他速率，具体根据细胞种类而定）的幅度变化，对细胞起到一定保护作用。
所以，在冷冻保护剂与梯度降温的保驾护航之下，细胞的存活得以长久实现，那么冻存复苏后的活性又如何呢？
03
长期冻存细胞的案例
我们来看看一些长时间细胞冻存的案例。
年，一枚27年前冷冻的胚胎被”唤醒“了，她被成功植入蒂娜·吉布森的子宫，并于当年12月顺利出生，这位特殊的宝宝打破了当前已诞生的胚胎冷冻时间的最长纪录（原为24年）[3]。
△虽然莫莉·吉布森只有一个多月大，但她其实能在过去27年里的任何时候出生
，国际期刊《JournalofImmunotherapy》文章[4]比较了短期冻存（＜1年）及长期冻存（1-10年）下NK细胞的功能差异，结果发现冻存时间长短并不会影响NK细胞的扩增及抗肿瘤功能，它们在对抗乳腺癌细胞的表现上没有差异。
△长期冻存的NK细胞依旧能产生促炎细胞因子、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α，显示出有效的抗肿瘤功能
年，湖南女孩晓颖（化名）接受了一份“沉睡”了15年的脐带造血干细胞的移植[5]，据官方数据显示，虽然已过15年，但这份干细胞的生命力依旧旺盛，移植前复苏活性检测高达94.2%。
而以“冷冻生物学”为主方向的期刊《Cryobiology》于年刊登一则名为”Effectivenessofhumanmesenchymalstemcellsderivedfrombonemarrowcryopreservedfor23-25years“的文章[6]，其中提到低温保存长达25年的骨髓干细胞仍然能作为实验中MSC的来源，它们在体外表现出良好的功能性和分化能力。
△实验证实：对存活细胞进行适当的解冻和培养后，可以获得有预期生物学特性的间充质干细胞
以上所有案例说明，只要保护到位，复苏得当，即使经历了漫长的冻存，细胞也依旧能保持足够的活性。
-℃的深低温存储，防“冻伤”的冷冻保护剂，精确到1度的逐级降温以及实验操作中的其他努力，这些让细胞能够保持活性地冻存5年、20年、甚至上百年，待到需要时再次提取，真正能做到让细胞“跨越时空”，为人们带去生的希望。
Writeinthelast
写在最后
不可能的“绝对零度”竞赛，却一定程度上提早了液氮的制成。很多大胆的想法都是如此，从异想天开开始，所引申出的结果却让科学越发灿烂、迷人。
如今人们又在长生之路上剑走偏锋，成功与否尚不得而知，但未来是可以期待的，毕竟谁又能说，人类迈向永生的第一步，不会是微观层面上的细胞冻存呢？
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参考资料：
[1]