北京权威白癜风专科医院 http://wapyyk.39.net/bj/zhuanke/89ac7.html低温冷冻保藏
1、安瓿管或冻存管的准备
用圆底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。将冻存管或安瓿管清洗干净，℃下高压灭菌15-20分钟，备用。
2、保护剂的准备
保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度，一般采用10-20%甘油。
3、微生物保藏物的准备
微生物不同的生理状态对存活率有影响，一般使用静止期或成熟期培养物。
分装时注意应在无菌条件下操作。
菌种的准备可采用下列几种方法：
刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内；
接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内；
将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约5-10毫米），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内；
在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基，接种菌种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。
4、预冻
预冻时一般冷冻速度控制在以每分钟下降1℃为好、使样品冻结到-35℃。
目前常用的有三种控温方法：
——程序控温降温法，应用电子计算机程序控制降温装置，可以稳定连续降温，能很好地控制降温速率。
——分段降温法：将菌体在不同温级的冰箱或液氮罐口分段降温冷却，或悬挂于冰的气雾中逐渐降温。一般采用二步控温，将安瓿管或塑料小管，先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小时，然后取出放入液氮罐中快速冷冻。这样冷冻速率大约每分钟下降1-1.5℃。
——对耐低温的微生物、可以直接放入气相或液相氮中。
5、保藏
将安瓿管或塑料冻存管置于液氮罐中保藏。一般气相中温度为-℃，液相中温度为-℃。
6、保藏周期
一般10年以上。
7、复苏方法
从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。
冷冻干燥保藏
1、安瓿管准备
安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，℃下高压灭菌15-20分钟，备用。
2、保护剂的选择和准备
保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。
3、冻干样品的准备
在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》（试行）），与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于-个/ml为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支）。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。
4、预冻
一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。
5、冷冻干燥
采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。
将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。
终止干燥时间应根据下列情况判断：
——安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状
——真空度接近空载时的最高值
——样品温度与管外温度接近
——选用1-2支对照管，其水份与菌悬液同量，视为干燥完结
——选用一个安瓿管，装1-2%氯化钴，如变深兰色，可视为干燥完结
冷冻干燥完毕后，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。
6、真空封口及真空检验
将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。
熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。
7、保藏
安瓿管应低温避光保藏。
8、质量检查
冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。
液氮保藏应注意事项
防止冻伤，操作注意安全，带面罩及皮手套
塑料冻存管一定要拧紧螺帽
运送液氮时一定要用专用特制的容器，绝不可用密闭容器存放或运输液氮，切勿使用保温瓶存放液氮
注意存放液氮容器的室内通风，防止过量氮气使人窒息
防止安瓿管或塑料冻存管破裂爆炸，如液氮渗入管内，当从液氮容器取出时，液态氮体积膨胀约倍，爆炸力很大，要特别小心
注意观察液氮容器中液氮的残存量，定期补充液氮。
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