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蛋白质科学研究平台生物成像中心在原位冷冻 [复制链接]

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侯文茹

年7月8日,国际结构生物学领域权威期刊《JournalofStructuralBiology》在线发表了由中国科学院生物物理研究所蛋白质科学研究平台生物成像中心与孙飞研究组合作的技术创新成果《VHUT-cryo-FIB,amethodtofabricatefrozenhydratedlamellaefromtissuespecimensforinsitucryo-electrontomography》,针对组织样品原位结构生物学研究的技术瓶颈开发了组织样品冷冻含水切片制备技术VHUT-cryo-FIB,这是该中心在年开发的细胞样品冷冻含水切片制备技术(JournalStructuralBiology,,:-)后的又一技术创新,将原位结构生物学的研究对象从单细胞拓展到更接近于生理状态的组织样品。

冷冻电子断层成像技术(cryo-electrontomography,cryo-ET)是一项重要的冷冻电镜技术,可以获得细胞和组织样品原位三维高分辨率超微结构、生物大分子的原位结构信息以及蛋白质机器原位相互作用信息。该技术被认为是分子生物学和细胞生物学联结的桥梁,被称为“可视化蛋白质组学”。然而该技术要求样品的厚度必须在nm以下,获取高分辨率信息则需要更薄的样品(nm以下),但是大多数生物样品厚度都在数微米以上,无法直接应用该技术进行研究。此外,为了研究生物组织样品更接近生理状态的结构,通常需要利用高压冷冻技术对生物组织样品进行冷冻固定,但是高压冷冻后的样品厚度一般都在μm以上,如何制备出适合冷冻电子断层成像技术研究的高质量的生物组织样品切片是原位结构生物学领域面临的一个重要技术问题。

本项技术研究基于最新的冷冻聚焦离子束技术(cryo-FIB),设计和研制了一套冷冻传输硬件,有效将振颤切片技术、高压冷冻技术、冷冻修块技术和冷冻聚焦离子束减薄技术结合起来,创新冷冻聚焦离子束切割工艺,形成了一套完整高效的组织样品冷冻含水切片制备技术流程VHUT-cryo-FIB。利用该技术流程可以高效制备出厚度在-nm之间的组织样品冷冻含水切片。本研究中应用VHUT-cryo-FIB方法分别制备了菠菜叶片、小鼠骨骼肌、肝脏和心肌的冷冻含水切片,并成功解析了菠菜胞质核糖体(34?)和小鼠肝脏胞质核糖体(18?)的原位三维结构(图1)。这些结果证明VHUT-cryo-FIB方法可以广泛应用于各种生物组织样品的冷冻含水切片制备,为原位结构生物学研究提供有力的样品制备方法。

图1.Cryo-FIB方法制备的冷冻含水切片样品,Cryo-ET方法解析菠菜叶片和小鼠肝样品中核糖体三维结构。a菠菜叶片重构后的细胞内部结构,其超微结构包括细胞壁、细胞质、叶绿体、囊泡、核糖体和基粒。b三维渲染后的图a,黄色,核糖体;淡粉色,细胞壁;橙色,细胞膜;紫色,囊泡;绿色,叶绿体膜;青色,叶绿体基质。菠菜核糖体的原位结构,大亚基蓝色的,小亚基黄色。cSubtomoaverage得到小鼠肝脏核糖体的原位结构(左),与通过单粒子重构得到小鼠胞质核糖体密度图(右)。d小鼠肝脏核糖体原位结构密度图,大亚基和小亚基分别为蓝色和黄色。红色(P/E位点)和紫色(A/P位点)显示了两个tRNAs。Scalebar:nm。

孙飞研究员为该论文的通讯作者,高级工程师张建国、孙飞研究组张丹阳博士(已毕业)和高级工程师孙磊为共同第一作者。蛋白质科学研究平台生物成像中心的多位工程师季刚、黄小俊、牛彤欣为该项成果贡献了力量,徐伟研究员为实验的设计和方向提供建议。北京大学生命科学学院的高宁教授和马成英博士在小鼠肝脏核糖体数据分析方面给予了帮助。

该工作受到国家自然科学基金委、科技部重点研发计划、北京市科委等的资助。

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