儿童白癜风公益活动 http://pf.39.net/bdfyy/bdfrczy/171021/5779537.html撰文：xiaoyudian
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亮点
文章开发了原子分辨率的冷冻电镜，实现了分辨率和密度图质量上的改进。并通过该仪器实现了去铁铁蛋白更加精确的3D结构，提供了氢原子的密度和单个原子化学修饰的图像，这为蛋白质的催化研究及相关的药物开发提供了基础。
近日，德国哥廷根大学结构动力学系研究人员KaManYip等人在《Nature》上发表了一篇名为“Atomic-resolutionproteinstructuredeterminationbycryo-EM”的文章。文中获得的最新开发的冷冻电镜，并提供了1.25?分辨率的去铁铁蛋白结构。这种3D信息内容几乎是当前世界纪录重建的两倍(分辨率为1.54?)。从本研究中可以看到蛋白质中的单个原子以及氢原子的密度和单个原子化学修饰的图像，真正实现了冷冻电镜分辨率和密度图质量的实质性改进。
近年来，冷冻电镜(cryo-EM)在测定大分子配合物的高分辨率结构方面取得了快速和指数增长，并伴随着结构可达到的最高分辨率的不断变化。在此背景下，研究者采用新的硬件来确定蛋白质的结构在真正的原子分辨率，实现了蛋白质中包括氢原子在内的所有原子的可视化。
首先，研究者采用了一个装有附加电子光学元件的原型仪器来提高电子显微镜的性能。一个单色仪和一个第二代球差校正器安装在TitanKriosG3的电子显微镜中，装备一个Falcon3直接电子探测器。这种硬件组合通过减少电子束的能量扩散和减少光学像差改善了光学特性。作为参考，这里使用的显微镜的能量扩散约为0.1eV，增加了时间相干性，减少了图像中高分辨率结构细节的衰减(图1)。附加的BCOR球差校正器可以提供没有轴和轴外彗差的图像，在1?分辨率下，这是最大的极限像差。此外，BCOR校正器可以校正五阶像差。对于相对较小的物体，这些值在获得3?分辨率结构时可以忽略，但是对于较大的大分子配合物和/或接近原子分辨率时，这些值会成为分辨率限制。因此，从该显微镜获得的图像通常不需要通过图像处理方法对线性放大变形或彗差进行后续校正，而从标准电子显微镜获得的图像则需要这样的校正。
由于生物物体对光束的敏感性，它们被成像时的电子剂量很低，因此成像时受到大量噪音的干扰。为了解决这个问题，图像处理需要平均计算出几十万甚至几百万个粒子图像。获得特定分辨率所需的粒子图像数量可以用实验B因子来描述。当粒子数的对数与分辨率的平方倒数作图时，粒子数与分辨率之间的关系变为线性，实验B因子由曲线的斜率确定(图2)。实验B因子代表了一个给定电子显微镜的所有分辨率限制因子的总结，并描述了仪器设置的总体质量。此外，B因子图使我们能够推断需要多少粒子才能达到更高的分辨率(图2b)。从现有的商用总结发现最先进的电子显微镜硬件及其B因子可以预测，数千亿去铁铁蛋白粒子图像将被要求达到1?分辨率(图2)。这表明，考虑到目前市面上最好的显微镜硬件，1?分辨率的重建将超出任何现实的期望冷冻电镜。
尽管电子和X射线光子的散射是本质上不同的物理事件，但到目前为止发表的23.5?体系中蛋白质的结构显示出与用X射线晶体学发现的结构相似的特征。为了获得高分辨率的去铁铁蛋白结构，实验中使用金替换的定量网格记录图像。通过对网格制备和成像条件的优化，使用大约1,,个粒子图像，最终没有使用任何软件对彗差或高阶像差进行校正，获得了1.25?分辨率的地图。当使用低阈值进行地图可视化时，在此分辨率下，与X射线图相比，增强的1.25?图显示了明确定义的额外密度，与几乎所有原子上氢的位置一致(图3)。
在冷冻电镜中，地图的分辨率是由傅里叶空间中不同分辨率壳层中两个独立的计算结构(FSC)的相关性估计的。中间分辨率的原子模型改进很大程度上依赖于化学的知识。在原子分辨率下，从结构中收集到的信息密度应该允许原子建模不受约束，并使实验观察与标准化学稍有偏差。亚埃分辨率结晶学揭示了这种畸变，增强了酶促反应中间体的酶反应活性。此外，这些关于蛋白质结构的详细的、实验性的和不带偏见的观点可以为特定药物的设计提供宝贵的见解。虽然允许存在一定的偏差，但高质量高分辨率冷冻电镜图应该允许建模的蛋白质没有总体的系统偏离正常的化学结构，并允许在不受约束的方式下根据实验图改进原子模型。其它质量评估指标包括有序溶剂的丰度和有序溶剂分子与蛋白质的配位距离。
通过对全数据集采用Relion3.1中的高阶像差校正，可以将分辨率提高到1.15?。1.15?结构在最高分辨率中没有显示任何数据，也没有额外的结构细节来支持该模型，说明基于FSC的分辨率声明可能会受到图像处理的潜在影响。分辨率为1.33?的图，除了对散焦和散光进行校正外，没有其他校正，在模型细化期间表现最好。
对于具有良好生化质量和稳定性的样品，其三维密度图的分辨率和质量依赖于电子显微镜硬件。对于绝大多数大分子配合物，分辨率的提高也将很大程度上依赖于生化样品质量的提高，以及能够处理数据中连续构象运动的图像分类工具。尽管仅用22,个粒子就有可能获得1.5个分辨率，但对于非对称和更动态的复合物，所需的粒子数可能要高出几个数量级。通过更快的相机和优化的数据采集方案进一步提高图像记录速度，将大大有助于在未来实现这些目标。
总之，本研究提供了一个极高分辨率的去铁铁蛋白的结构，允许研究它的原子细节。为了更有挑战性的复杂结构更有规律地达到真正的原子分辨率，还需要改进网格准备、图像分类软件和显微镜硬件。这些在cryo-EM技术各方面的改进有望在不久的将来实现。未来将获得更多大分子复合物的原子分辨率的结构，提高对蛋白质催化机制的理解，有助于基于高分辨率、高质量的蛋白质3D结构新药的开发。
教授介绍
HolgerStark，德国哥廷根大学教授，结构动力学系主任。目前该课题组主要利用单粒子电子冷冻显微技术解析大分子的三维结构，其中主要集中于snRNPs的剪接体，以获得真核细胞前mRNA剪接的结构信息。除此之外，还在进行核糖体、病*和氧载体项目。目前已在Nature及其子刊上发表多篇高影响力论文。
参考文献
Yip,K.M.,Fischer,N.,Paknia,E.etal.Atomic-resolutionproteinstructuredeterminationbycryo-EM.Nature().
